其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時暴露出的3′-羥基（3′-OH）末端摻入被Alexa Fluor 488染料標(biāo)志的dUTP，使凋亡的細(xì)胞被標(biāo)志上綠色熒光，從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。

本試劑盒為直接熒光標(biāo)志法的TUNEL染色，染色步驟簡便，應(yīng)用范圍廣泛，可用于檢測冰凍切片、石蠟切片和培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡情況。
包裝清單：

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒產(chǎn)品組成：

保存條件：

-20 ℃保存，一年有效。

操作步驟：

1、樣本處理：

a) 石蠟切片：經(jīng)二甲笨、酒精脫蠟，復(fù)水。脫蠟應(yīng)充分。

b) 冰凍切片：流水沖洗，去除OCT包埋膠后，用純水洗3次。

c) 細(xì)胞飛片：用組織固定液固定后，用PBS洗三次，每次5分鐘。1% Triton X-100處理10分鐘，用PBS洗三次，每次5分鐘。

2、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋于50ul PBS中，滴加到組織上，37℃孵育10-20分鐘。消化結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

3、陽性對照組織的處理

將組織用DNase I消化，以獲得斷裂的DNA，即成Tunel染色陽性的對照。陽性對照組織也可以選用小鼠的小腸組織切片。

將50 ul DNase I消化液滴加于組織上，37℃孵育10-30分鐘，消化結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

4、Tunel標(biāo)志染色:

Tunel標(biāo)志染色前用50 ul Equilibration Buffer孵育標(biāo)本5-10分鐘。孵育過程中按下表配制Tunel染色工作液。去除標(biāo)本上的Equilibration Buffer后，直接滴加50ul Tunel染色液，37℃孵育1-2小時，染色結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

5、封片：

每組織上滴加一滴封劑，小心蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。用吸水紙吸去多余的封片劑。熒光顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)：

1、Proteinase K 消化時間需要摸索，冰凍切片 10 min 左右，石蠟切片時間應(yīng)適當(dāng)延長。

2、陰性對照體系：配制Tunel染色工作液時用純水替代TdT Enzyme。

3、懸浮細(xì)胞用離心的方法收集細(xì)胞，所有反應(yīng)在離心管中進(jìn)行，染色結(jié)束后，可在熒光顯微下觀察，也可以用流式細(xì)胞儀檢測。

4、Tunel標(biāo)志染色時應(yīng)注意避光。

5、實(shí)驗(yàn)過程中請穿戴手套、實(shí)驗(yàn)服等，做好個人防護(hù)。